以下實(shí)驗(yàn)方案介紹了貼壁培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞傳代的一般流程。請注意昆蟲細(xì)胞與哺乳動物細(xì)胞傳代的一些關(guān)鍵步驟有所不同。更多信息請參閱下一頁的“昆蟲細(xì)胞傳代的注意事項(xiàng)”部分。

為自己所用的細(xì)胞系傳代時，建議您嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)中所有產(chǎn)品附帶的操作說明。偏離某種細(xì)胞所需的培養(yǎng)條件會導(dǎo)致細(xì)胞表型異常，甚至培養(yǎng)*失敗。

所需材料      ：裝有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)容器

              ：經(jīng)過組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿

  ：*生長培養(yǎng)基，預(yù)熱至37℃

  ：一次性無菌15-ml試管

  ：37℃培養(yǎng)箱，充有二氧化碳濃度為5％的濕化空氣

  ：平衡鹽溶液，例如：杜爾貝科磷酸鹽緩沖液（DPBS），不含鈣、鎂和酚紅  

  ：解離劑，例如：胰蛋白酶或TRYPLE™EXPRESS,不含酚紅

              ：用于活細(xì)胞和總細(xì)胞計(jì)數(shù)的試劑和設(shè)備，例如：countess™||自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、臺盼藍(lán)染料或血球計(jì)數(shù)器。

貼壁細(xì)胞傳代流程    所有與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)工作。

1. 從培養(yǎng)容器中吸出用過的細(xì)胞培養(yǎng)基并丟棄
2. 用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液沖洗細(xì)胞（每10cm ²)培養(yǎng)表面面積需要2ml溶液）。從與貼壁細(xì)胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動細(xì)胞層，前后搖晃容器數(shù)次。

注：沖洗步驟可去除可能抑制解離劑作用的少量血清、鈣和鎂。

1. 從培養(yǎng)器中吸出沖洗液并丟棄。
2. 向培養(yǎng)瓶中加入預(yù)熱的解離劑（例如：胰蛋白酶或tryple™）；試劑量應(yīng)足以覆蓋細(xì)胞層（每10cm2大約0.5ml）。輕輕搖晃容器，使試劑*覆蓋細(xì)胞層。
3. 將培養(yǎng)容器在室溫下孵育約2分鐘。請注意實(shí)際孵育時間根據(jù)所用細(xì)胞系不同而有所差異。
4. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞解離情況。如果解離程度未達(dá)90％，可將孵育時間延長幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況，也可輕輕拍打培養(yǎng)容器以加快細(xì)胞解離。
5. 細(xì)胞解離程度大于90％時，傾斜培養(yǎng)容器，使細(xì)胞上液體盡快流盡。加入所用解離劑兩倍體積的預(yù)熱*生長培養(yǎng)基。吹打細(xì)胞層表面數(shù)次，使培養(yǎng)基分散。
6. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15-ml錐形管中，以200×g的離心力離心5至10分鐘。請注意離心速度和時間依細(xì)胞種類不同有所差異。
7. 用少體積的預(yù)熱*生長培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀，取出少量樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。
8.   采用血球計(jì)數(shù)器、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀按照臺盼藍(lán)拒染法或者使用countess™||自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞百分比。必要時，可再次向細(xì)胞中加入生長培養(yǎng)基，以便達(dá)到所需的細(xì)胞溶度，并重新進(jìn)行計(jì)數(shù)。

注：我們建議使用countess™||自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞百分比。Countess™||自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)所需的樣本量與您目前使用的血球計(jì)數(shù)器所需量相同，且不到10秒鐘即可完成一個樣本的典型細(xì)胞計(jì)數(shù)，適用于各種真核細(xì)胞。

             11：將細(xì)胞懸液稀釋到該細(xì)胞系推薦的接種密度，并將適量體積的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)容器中，把細(xì)胞放回培養(yǎng)箱。

             注：如果使用培養(yǎng)瓶，將其放入培養(yǎng)箱前應(yīng)將瓶蓋旋松，以便進(jìn)行充分的氣體交換，除非您使用的是通風(fēng)式培養(yǎng)瓶和透氣性瓶蓋。

貼壁昆蟲細(xì)胞傳代的注意事項(xiàng)

雖然昆蟲細(xì)胞傳代的一般步驟與哺乳動物細(xì)胞相同，但是這些培養(yǎng)系統(tǒng)的一些關(guān)鍵要求有所不同。為了獲得滿意結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中必須嚴(yán)格遵守所有產(chǎn)品附帶的操作說明。

1. 昆蟲細(xì)胞應(yīng)在對數(shù)期傳代。但是，如果培養(yǎng)的是強(qiáng)貼壁性昆蟲細(xì)胞，則應(yīng)在細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)或者剛剛開始從培養(yǎng)瓶底部脫離時進(jìn)行傳代，因?yàn)榇藭r細(xì)胞容易脫離。
2. 細(xì)胞密度低于匯合狀態(tài)的20％時，細(xì)胞生長會受到抑制。健康狀態(tài)的細(xì)胞是對數(shù)期收獲的細(xì)胞。
3. 培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞時建議不要二氧化碳交換。
4. 昆蟲細(xì)胞應(yīng)于27℃、非濕化環(huán)境中培養(yǎng)。在避光條件下可將細(xì)胞放在操作臺上或者放入抽屜中于室溫下培養(yǎng)。但是，建議使用溫度控制在27℃的環(huán)境。
5. 使用昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)基。
6. 在無血清培養(yǎng)條件下，昆蟲細(xì)胞與基質(zhì)貼附極為牢固，需要花費(fèi)較大力氣才能使其脫落。要使細(xì)胞脫落，可以采用拍掌的動作快速振搖一下培養(yǎng)瓶。為了避免污染，進(jìn)行此操作前必須蓋緊蓋子。

  警告：建議不要劇烈搖晃培養(yǎng)瓶，因?yàn)檫@樣可能會造成細(xì)胞損傷。

PS:如需細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)產(chǎn)品，敬請聯(lián)系我司！