CaEs-17人食管癌細(xì)胞

細(xì)胞英文(簡稱）:CaES-17
細(xì)胞來源:   ATCC  DSMZ   JCM   ECACC
代次:P3
規(guī)格:T25
細(xì)胞數(shù):1x10^⁶ cells
組織來源:食管癌
細(xì)胞形態(tài):貼壁；上皮細(xì)胞樣
細(xì)胞活力:95％（Viability by Trypan Blue Exclusion）
細(xì)胞檢測(cè):細(xì)胞不含有:HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌
培養(yǎng)條件:DMEM(高糖) +10% FBS；37℃，5% CO2
傳代方法:建議:1:2-1:3 兩天換液一次
凍存條件:*培養(yǎng)基50%+40%FBS+10%DMSO?
CaEs-17人食管癌細(xì)胞

傳代細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟
1、        37度水浴加熱所有試劑。
2、        吸取培養(yǎng)培養(yǎng)皿內(nèi)舊培養(yǎng)液，放置一個(gè)干凈離心管內(nèi)。（為稍后終止消化作準(zhǔn)備。）
3、        用PBS清洗培養(yǎng)皿，棄去。
4、        向瓶內(nèi)加入消化液（胰蛋白酶液）。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。（一般一個(gè)大皿1ml）
5、        2-5分鐘后，輕輕震蕩培養(yǎng)皿。使細(xì)胞從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。顯微鏡下觀察若細(xì)胞由貼壁變?yōu)閼腋【图尤胙澹丛囵B(yǎng)液）終止消化。
6、        收集細(xì)胞懸液，880轉(zhuǎn)/分、5分鐘離心，棄去上清液。
7、        加培養(yǎng)液至1ml，混勻后取10ul計(jì)數(shù)細(xì)胞。
8、        根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求取適量細(xì)胞留種或接種于新的培養(yǎng)皿或96孔板、24孔板中，再加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)液。（90mm大皿是9ml，中皿好像是4mm，6孔板和小皿是2ml，96孔板是100ul）。
9、        接種好的培養(yǎng)皿順時(shí)針和逆時(shí)針各轉(zhuǎn)三圈，使細(xì)胞排列均勻。
10、        放入暖箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟：
1、將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上.
2、將細(xì)胞懸液吸出少許，用臺(tái)盼蘭溶液對(duì)被稀釋后滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。(臺(tái)盼蘭用于標(biāo)記死亡細(xì)胞。)
3、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板八大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：
細(xì)胞數(shù)/ml＝8大格細(xì)胞總數(shù)/ 8×2×10000
細(xì)胞凍存與復(fù)蘇：
凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融
當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。
　1．凍存細(xì)胞
（1）選對(duì)數(shù)增生期細(xì)胞，在凍存前1d換液。
（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)5×106／m1左右密度，離心，去上清。
（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞成再懸液。凍存細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷
（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m1懸液。
（5）旋好凍存管并仔細(xì)檢查，一定要蓋緊，作好標(biāo)記。
（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度,在30～40 min時(shí)間內(nèi),下降到液氮表面，再停30 min后，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。
標(biāo)準(zhǔn)程序：
當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)， 1～2℃/min
當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)， 5～10℃/min
當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中
簡易程序：
將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。
　　操作時(shí)應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套，以免液氮凍傷。
2. 復(fù)蘇細(xì)胞
（1）從罐中取出凍存管。
（2）迅速放入37℃水浴，不時(shí)搖動(dòng)，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后,打開蓋子,用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中,再滴加10 m1培養(yǎng)液。
（4）低速離心(880r／min) 5 min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。
（5）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。
　　凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，密度應(yīng)達(dá)到107／m1，在融后稀釋20倍后，仍能保持5×105／m1數(shù)量。