caki-1人腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細(xì)胞

細(xì)胞縮寫：    Caki-1細(xì)胞
    細(xì)胞名稱：    Caki-1(人腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細(xì)胞)
    詳細(xì)背景：    超微結(jié)構(gòu)中包含許多微絨毛，少許微絲，許多小線粒體，充分發(fā)育的高爾基休和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，許多脂滴和多層體，次級溶酶體，沒有發(fā)現(xiàn)病毒顆粒。
    細(xì)胞來源：    細(xì)胞主要來源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少數(shù)國內(nèi)外著名大學(xué)建系
    "購買細(xì)胞注意事項：
1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。
2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，細(xì)胞了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等。
3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運輸問題貼壁細(xì)胞會有少量從瓶壁脫落，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)過夜，隔天再取出觀察。此時多數(shù)細(xì)胞均會貼壁，若細(xì)胞仍不能貼壁請用臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞活力，如果證實細(xì)胞活力正常，請將細(xì)胞離心后用新鮮培養(yǎng)基再次貼壁培養(yǎng)；如果染色結(jié)果顯示細(xì)胞無活力，請拍下照片及時和我們聯(lián)系，信息確認(rèn)后我們?yōu)槟倜赓M寄送一次。
4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和公司技術(shù)部溝通交流。"    P4
    包裝規(guī)格：    復(fù)蘇T25培養(yǎng)瓶(一瓶)或凍存1ml凍存管（兩支）
    細(xì)胞規(guī)格：    1*10(5)/ml——1*10（6）/ml
    安全水平：    1
    細(xì)胞種屬：    人
    組織來源：    腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移
    細(xì)胞形態(tài)：    上皮細(xì)胞樣
    細(xì)胞特性：    貼壁
    細(xì)胞融合度：    95％（Viability by Trypan Blue Exclusion）
    細(xì)胞檢測：    細(xì)胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌
  caki-1人腎透明細(xì)胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細(xì)胞

 "細(xì)胞培養(yǎng)三不要：
養(yǎng)科研細(xì)胞是生物醫(yī)學(xué)研究的基本功。有三個小經(jīng)驗可以和大家分享一下：
1. 不要燒瓶口。大多數(shù)人都喜歡在酒精燈的火焰上關(guān)瓶子，覺得這樣可以避免污染。不知道大家是不是有培養(yǎng)基怎么越用越發(fā)紫的困惑？知道為什么嗎？燒瓶口燒的。培養(yǎng)基一般都是用碳酸/碳酸氫跟作緩沖體系。瓶口在火焰上的時候，熾熱的空氣進(jìn)入瓶內(nèi)。塞緊塞子放入冰箱后，空氣變冷，壓力驟降，培養(yǎng)基中的碳酸就會轉(zhuǎn)化成二氧化碳，釋放出來。培養(yǎng)基中的碳酸少了，當(dāng)然會變堿。如果不燒瓶口的話，你會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變堿的速度會大大減慢。（當(dāng)然多多少少還是會有一點越用越堿，因為室溫還是比冰箱內(nèi)的溫度高）
其實燒瓶口防止污染純粹是心理安慰。不妨試一下把手指在火上晃幾下，你會發(fā)現(xiàn)根本就不會燒疼。如果有細(xì)菌的話，這么晃兩下也燒不死多少。要想燒死全部細(xì)菌，除非把瓶口和塞子燒紅。我在國內(nèi)從來就不燒瓶口。來美國以后發(fā)現(xiàn)這里更*，超凈臺內(nèi)根本就不點酒精燈。
2. 不要頻繁看細(xì)胞。對于初學(xué)者而言，養(yǎng)細(xì)胞就像養(yǎng)孩子一樣，有空就要去看看。細(xì)胞越是養(yǎng)不好，就越是經(jīng)常去看。實際上看細(xì)胞對細(xì)胞的生長沒有任何好處，特別是對原代細(xì)胞或是免疫磁珠分選后，密度特別低的細(xì)胞。培養(yǎng)基中的生長因子是非常有限的。細(xì)胞好不容易自分泌一點兒促生長的因子在其周圍，形成有利于生長的局部環(huán)境。你跑去看細(xì)胞，培養(yǎng)瓶這么一晃，把因子都給晃散了。經(jīng)常可以看到新手一天到晚都在看細(xì)胞，細(xì)胞老是長不好。老手細(xì)胞一扔好幾天不管，細(xì)胞瘋長。
3. 不要怕消化。在傳代的時候，初學(xué)者往往生怕細(xì)胞消化過度，早早地終止消化。細(xì)胞沒下來就使勁吹燈，吹得滿瓶子都是氣泡。在我看來，用力吹打?qū)?xì)胞的損傷比消化更大。我?guī)熜衷谧鲅芷交≡臅r候，37度消化過夜，細(xì)胞也沒事。我一般是等細(xì)胞*變圓后才中止消化。細(xì)胞輕輕一晃就能下來。還有，動作要輕柔，盡量不要產(chǎn)生氣泡。氣泡在破裂時的機(jī)械應(yīng)力相當(dāng)大，對細(xì)胞的傷害也是很大的。"    詳見細(xì)胞說明書
    傳代方法：    建議1:2-1:3 兩天換液一次
    凍存條件：    詳見細(xì)胞說明書
    主要文獻(xiàn)：    請具體查閱相關(guān)發(fā)表文章
傳代細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

1、        37度水浴加熱所有試劑。
2、        吸取培養(yǎng)培養(yǎng)皿內(nèi)舊培養(yǎng)液，放置一個干凈離心管內(nèi)。（為稍后終止消化作準(zhǔn)備。）
3、        用PBS清洗培養(yǎng)皿，棄去。
4、        向瓶內(nèi)加入消化液（胰蛋白酶液）。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。（一般一個大皿1ml）
5、        2-5分鐘后，輕輕震蕩培養(yǎng)皿。使細(xì)胞從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。顯微鏡下觀察若細(xì)胞由貼壁變?yōu)閼腋【图尤胙澹丛囵B(yǎng)液）終止消化。
6、        收集細(xì)胞懸液，880轉(zhuǎn)/分、5分鐘離心，棄去上清液。
7、        加培養(yǎng)液至1ml，混勻后取10ul計數(shù)細(xì)胞。
8、        根據(jù)實驗要求取適量細(xì)胞留種或接種于新的培養(yǎng)皿或96孔板、24孔板中，再加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)液。（90mm大皿是9ml，中皿好像是4mm，6孔板和小皿是2ml，96孔板是100ul）。
9、        接種好的培養(yǎng)皿順時針和逆時針各轉(zhuǎn)三圈，使細(xì)胞排列均勻。
10、        放入暖箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞計數(shù)步驟：
1、將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上.
2、將細(xì)胞懸液吸出少許，用臺盼蘭溶液對被稀釋后滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。(臺盼蘭用于標(biāo)記死亡細(xì)胞。)
3、鏡下觀察，計算計數(shù)板八大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：
細(xì)胞數(shù)/ml＝8大格細(xì)胞總數(shù)/ 8×2×10000
細(xì)胞凍存與復(fù)蘇：
凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融
當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。
　1．凍存細(xì)胞
（1）選對數(shù)增生期細(xì)胞，在凍存前1d換液。
（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)5×106／m1左右密度，離心，去上清。
（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞成再懸液。凍存細(xì)胞時培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷
（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m1懸液。
（5）旋好凍存管并仔細(xì)檢查，一定要蓋緊，作好標(biāo)記。
（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度,在30～40 min時間內(nèi),下降到液氮表面，再停30 min后，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。
標(biāo)準(zhǔn)程序：
當(dāng)溫度在-25℃以上時， 1～2℃/min
當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時， 5～10℃/min
當(dāng)溫度達(dá)-100℃時，可迅速放入液氮中
簡易程序：
將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。
　　操作時應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套，以免液氮凍傷。
2. 復(fù)蘇細(xì)胞
（1）從罐中取出凍存管。
（2）迅速放入37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后,打開蓋子,用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中,再滴加10 m1培養(yǎng)液。
（4）低速離心(880r／min) 5 min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。
（5）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。
　　凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，密度應(yīng)達(dá)到107／m1，在融后稀釋20倍后，仍能保持5×105／m1數(shù)量。